Ad oggi, l’unico farmaco approvato da FDA (US Food and Drug Administration) per il trattamento della Covid-19 è il Remdesivir, che agisce inibendo la proteina responsabile della replicazione del genoma virale (la RNA polimerasi RNA-dipendente, RdRP). La ricerca di altri composti è però ancora in corso. Ad esempio, uno studio recente ha identificato, sulla base di uno screening di 12.000 composti, alcune piccole molecole in grado di inibire la replicazione e l’infezione virale.
I farmaci agiscono interferendo con meccanismi chiave dell’infezione virale e SARS-CoV2 ha bisogno di diversi fattori della cellula ospite per poter infettare le cellule e replicarsi. Ad esempio, il recettore ACE2 –espresso sulla superficie delle cellule umane− è necessario per il legame del virus alle cellule e la successiva infezione. Inoltre, in seguito al legame della proteina virale Spike al recettore ACE2, la proteina Spike viene tagliata da proteine della cellule ospite (es. TMPRSS2, catepsina L); il taglio è necessario per l’attivazione della proteina Spike, la fusione del virus con la membrana della cellula ospite e il rilascio del genoma virale all’interno della cellula. Successivamente, il virus si replica sfruttando sia le proprie proteine che quelle della cellula ospite.
Risultati principali. In un articolo recentemente pubblicato sulla rivista Cell, gli autori identificano diversi geni della cellula ospite umana necessari per l’infezione virale, la cui inibizione riduce l’infezione da SARS-CoV2. Questi geni potrebbero quindi rappresentare un potenziale target farmacologico per un trattamento efficace contro l’infezione da SARS-CoV2.
Dettagli sperimentali. Gli autori effettuano uno screening utilizzando il metodo CRISPR1 (ovvero eliminando in maniera mirata geni specifici al fine di identificare quelli che conferiscono alle cellule la capacità di sopravvivere all’infezione), in cellule polmonari umane (la linea cellulare A549) in cui è stato espresso il recettore ACE2.
Identificazione di geni della cellula ospite con un ruolo chiave nell’infezione virale. Lo screening ha permesso di individuare diversi geni coinvolti in meccanismi critici per l’entrata del virus nelle cellule umane e per la sua replicazione, come ACE2; geni coinvolti nel taglio della proteina Spike e la successiva fusione della membrana virale con quella della cellula umana; geni del trafficking tra reticolo endoplasmatico e apparato del Golgi (movimento di proteine tra i due compartimenti cellulari); geni del recycling degli endosomi (processo in cui porzioni della membrana plasmatica internalizzate tornano alla superficie cellulare per essere riutilizzate); modulatori dell’espressione genica. Ad eccezione di ACE2, i geni identificati sono espressi in quasi tutti i tessuti, suggerendo che i meccanismi coinvolti potrebbero essere gli stessi indipendentemente dal tessuto e dal tipo cellulare. Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che alcuni di questi geni/prodotti genici interagiscono direttamente con diverse proteine virali.
Questo approccio è stato utilizzato in passato per identificare geni necessari per l’infezione dei virus ZIKA e H1N1 e gli autori hanno evidenziato come molti dei geni critici per l’infezione di ZIKA siano anche critici per l’infezione di SARS-CoV2.
Validazione. Trenta dei geni identificati tramite screening sono stati selezionati per una ulteriore validazione. La delezione (tramite CRISPR) di tutti questi 30 geni riduce notevolmente l’infezione da SARS-CoV2 (di 10 volte). La maggiore protezione dall’infezione è legata principalmente all’assenza di geni quali ACE2, catepsina L e geni del trafficking delle vescicole (movimento di vescicole all’interno della cellula).
Meccanismo d’azione. Qual è il ruolo dei geni identificati tramite lo screening nell’infezione di SARS-CoV2? Gli autori hanno osservato che la perdita di uno di questi geni (RAB7A, una proteina che regola il trasporto delle vescicole e il trafficking di membrana) riduce l’espressione di ACE2 a livello della superficie cellulare: ACE2 si accumula in vescicole nel citoplasma.
Inoltre, l’assenza di 11 dei 30 geni identificati tramite lo screening altera il profilo di espressione genica, e 6 di questi geni modificano l’espressione genica in maniera simile, potenziando i pathway coinvolti nella omeostasi dei lipidi e del colesterolo (il colesterolo è un componente delle membrane delle cellule animali che ne influenza fortemente le proprietà fisiche). Un lavoro precedente aveva mostrato che l’infezione da SARS-CoV2 modula negativamente il pathway di sintesi del colesterolo e l’induzione farmacologica di questo pathway previene in maniera efficace l’infezione2. Sebbene studi ulteriori in futuro saranno necessari per definire i meccanismi che collegano il pathway di sintesi del colesterolo e la resistenza all’infezione da SARS-CoV2, vale la pena menzionare che cambiamenti nella composizione lipidica della cellula sono stati precedentemente associati all’abilità di infettare e la maturazione dei virus dell’influenza A e dell’epatite C.
Applicazione clinica delle scoperte. Qual è la rilevanza di queste scoperte dal punto di vista clinico? Confrontando l’intera lista di geni identificati tramite screening e la lista di geni del Drug Gene Interaction database (DGIdb) (ovvero geni o prodotti genici che sono noti o che si ipotizza possano interagire con determinati farmaci), gli autori hanno identificato sessantanove geni per cui sono disponibili dei farmaci. In particolare, tra questi sessantanove, nove geni sono risultati essere potenziali target di ventisei inibitori. Cellule umane che esprimono ACE2 sono state quindi pretrattate con gli inibitori e successivamente infettate con SARS-CoV2: sette dei ventisei inibitori hanno ridotto significativamente la carica virale (PIK-III, Compound-19, SAR405, autophinib, ALLN, tamoxifen and ilomastat). Tra queste sette molecole, quattro (Compound-19, PIK-III, autophinib, SAR405) agiscono sullo stesso gene –PIK3C3– e due (autophinib and ALLN) riducono la carica virale di oltre 1.000 volte. Inoltre, il trattamento combinato di questi farmaci ne potenzia gli effetti, aumentando la protezione contro l’infezione da SARS-CoV2.
Conclusioni. Gli autori hanno identificato alcuni geni delle cellule umane che giocano un ruolo chiave nell’infezione di SARS-CoV2 (la cui perdita è in grado di conferire resistenza all’infezione). Inoltre, i loro risultati sottolineano la rilevanza clinica di queste scoperte, mostrando che i farmaci disponibili contro alcuni di questi geni sono in grado di ridurre la carica virale delle cellule infettate con SARS-CoV2. Tra i farmaci identificati, ALLN è attualmente in studi clinici (per il trattamento di malattie diverse) e tamoxifen è approvato per il trattamento del tumore al seno.
Referenza. Identification of required host factors for SARS-CoV-2 infection in human cells. Zharko Daniloski, Tristan X. Jordan, […], Benjamin R. tenOever, Neville E. Sanjana. Cell 2020.
1CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats): tecnica per modificare il genoma che taglia il DNA in maniera precisa e mirata.
2Modulating the transcriptional landscape of SARS-CoV-2 as an effective method for developing antiviral compounds. Hoagland, D.A., Clarke, D.J.B., Møller, R., Han, Y., Yang, L., Wojciechowicz, M.L., Lachmann, A., Oguntuyo, K.Y., Stevens, C., Lee, B., et al. (2020). BioRxiv 2020.07.12.199687.